Ⅰ. 서 론

최근에는 미생물의 다양성과 환경에 대한 넓은 적응력을 이용하여 환경 폐기물 제거, 에너지 생산, 의약, 산업 공정, 농업 및 다양한 생명공학산업에서 오랫동안 풀지 못했던 숙제들의 해답을 얻기 위해 많은 관심과 연구가 진행되고 있다. 이러한 추세에 발맞춰 국외에서는 미생물을 이용하여 침강성 탄산칼슘을 생성시킴으로써 지반강도를 증진시키는 연구가 체계적으로 진행되어 상용화 되고 있는 실정에 있다. 국내에서는 지반강도증진 목적 이외의 재료적 측면에서 연구가 진행되고 미생물을 지반에 적용한 예는 점점 증가하는 실정에 있다. 미생물을 이용하거나 토사와의 기본적인 반응원리에 대한 국⋅내외의 연구는 다음과 같다.

국외의 연구로서 Tyler (1978)은 배설 능력을 가진 대부분의 유기체는 능동적으로 이동되는 질소 발생원에 의한 요소 (Urea) 혹은 세포내 세포질을 통해 수동적으로 확산되는 요소를 이용하며, 요소분해효소 (Urease)가 요소를 두 개의 암모니아 분자로 가수분해한다고 했다. Mörsdorf and Kaltwasser (1972)은 같은 유기체 내의 요소분해효소의 부산물들은 암모니아의 발생으로 억제된다고 하였다. 그러나 Proteus vulgaris 등은 고농축 암모니아가 발생되어 요소분해효소를 형성할 수 있다고 한다. Jahns (1996)은 Sporosarcina pasteurii에서 나온 양이온은 ATP (adenosine triphosphate) 합성물질이 암모니아가 되도록 세포막 포텐셜을 형성하는게 보통이며, 암모니아와 같이 직접적으로 혹은 요소와 같이 간접적으로 제공하기도 한다. Whiffin (2004)은 생물학적 고결 작용은 암모니아의 고농집을 발생시키는 결과를 야기하며, 이러한 박테리아 물질은 단지 암모니아의 발생을 조정하여 요소분해효소가 저하되지 않는 경우에 유용하다고 하였다. 이처럼 유기체로는 Sporosarcina pasteurii와 Proteus vulgaris가 있다고 발표하였다. 요소분해효소는 요소를 두 개의 암모니아 분자로 가수분해됨으로써 탄산칼슘 흡착이 시작되고 이들은 글루타민 합성글루타민 신타아제의 경로를 생물량으로써 직접적으로 흡수되거나 글루타민산염 탈수소효소 (GDH)의 작용에 의해 흡수된다고 하였다.

국내의 연구로서는 Yun et al. (2003)은 CaCl₂⋅2H₂O(NH₄)₂CO₃계에 NH₄OH를 첨가하여 수용액 반응에 의해 탄산칼슘 (CaCO₃)이 합성되었으며, pH의 농도의 증가에 따라 Vaterite의 비율이 증가한 결과를 발표하였다. 또한, Kim (1985)은 탄산칼슘은 이산화탄소 (CO₂)양의 감소, pH의 변화, 수분의 증발 등에 의하여 석회연이 (軟泥)로 생성되어 점차 결정화되어 탄산칼슘 (CaCO₃)이 되고, 석회조 등의 생물에 의한 생물화학적 침전이나 박테리아작용에 의한 유기질의 분해에 의해서도 탄산염이 잘 생성되며, 탄산염의 침전은 해수와 담수 (하천수, 지하수 등)가 잘 섞이는 곳에서 활발하게 행해진다고 하였다. 최근의 연구로는 Park and Kim (2012)는 Bacillus 균을 이용하여 요소 및 영양배지 (Nutirent broth)를 통해 요소분해요소를 생성함으로써 탄산칼슘이 생성된다고 하였으며, 또한 Park and Kim (2015)가 미생물 반응으로 생성된 탄산칼슘을 분말로 제작하여 모래의 강도증진 효과를 확인한바 있다. 이처럼 시멘트를 활용하지 않음으로써 시멘트 생산시 발생하는 이산화 탄소 감소를 목적으로 미생물 반응을 이용한 지반강도 증가 특성에 대한 최근 연구로서는 Van Panssen et al. (2010), Park et al. (2011) 등의 연구가 진행되었다. 또한 Kim et al. (2017)은 대표적인 탄산칼슘 생성 미생물인 Sporosarcina pasteuri i (Bacillus 균)을 이용하여 친환경 고결제와 미생물을 혼합한 점성토의 강도변화 특성을 알아보기 위한 실험을 수행하고 미생물의 탄산칼슘 생성작용으로 인한 고결화로 강도증가에 효과가 있다고 하였다.

이에 본 연구에서는 침강성 탄산칼슘을 생성하는데 역할을 하는 미생물 (Sporosarcina pasteurii)을 이용하여 지반의 강도에 영향을 줄 것으로 기대되는 탄산칼슘 생성에 관련된 다양한 시료의 배합조건에서 실험을 통해 미생물과 침강제가 토립자 사이에서 반응을 일으켜 표면에 흡착성 물질층이 형성되고, 공극이 채워져 단단한 입자로 결합되는 생물학적 고결 작용이 발생되는 지에 대한 실내시험을 통해 반응 메카니즘을 알아보고자 하였다. 본 연구결과를 토대로 강도증진에 관련된 추가 연구를 수행할 계획이다.

Ⅱ. 미생물 고결토의 반응 특성

Kitamura et al. (2001)는 미생물에 의해 생성된 탄산칼슘 (CaCO₃)은 calcite, vaterite, 및 aragonite로 구분되며 이 중 vaterite는 열역학적으로 가장 불안정하며 자연상태에서는 거의 존재하지 않는다고 하였다. 또한 Langelin et al. (1984)은 인공적으로 합성되는 탄산칼슘의 결정상 제어는 농도, 온도, pH 및 시간과 첨가물의 변화에 의해 가능하며 반응시간이 길어지면 vaterite ⟶ calcite, vaterite ⟶ aragonite ⟶ calcite, aragonite ⟶ calcite 전이에 의하여 최종적으로 calcite로 된다.

Yun et al. (2003)은 vaterite는 다른 결정으로 전이가 쉬운 준안정상태를 유지하므로 합성이 어려우나 높은 비표면적과 고용해도, 높은 분산성 및 작은 비중 등이 aragonite 및 calcite와 비교했을 경우, 다목적으로 이용이 기대되며, 특히 vaterite는 구형의 모양을 나타내어 분산성이 매우 좋고 반응성이 aragonite, calcite보다 높기 때문에 채움재 등으로서 사용될 때 다른 기질과의 반응성이 우수할 것으로 기대된다고 하였다.

요소는 척추동물에 의해 생성되는 주요 찌꺼기임 동시에 수생동물과 토양 생태계에 있어 주요 질소 자원으로 미생물 증식에 의해 탄산이온과 암모늄 이온을 가수분해시키며, 증식하는 미생물 중 탄산칼슘형성 미생물은 요소분해효소를 생성하여 탄산칼슘 형성반응을 촉진시키게 된다. 질소로부터 얻어지는 자연환경과 인류의 필수조건인 요소의 광역적인 효용성에 대응하여, 생물군에서 분화된 하나의 아종은 요소분해효소의 작용에 의해 가수분해된 요소의 작용에 의해 진화되어 왔다. 한국생명공학연구원 생물자원센터 생물자원 (KCTC: https://kctc.kribb.re.kr/search) 검색에서 본 연구와 관련된 요소분해효소 (urease)활동을 하는 미생물과 배지 종류를 요약한 것이 Table 1과 같다. 여기서 Biosafety level은 KCTC에서 제공된 자료를 수록한 것이다.

요소분해효소 (urease) 활동을 하는 미생물 중 사상균, 방선균은 배지조제 방법이 복잡하지만, Bacillus Pasteurii계열의 박테리아는 일반배지와 함께 요소의 첨가만으로 그 성장이 이루어지므로 편리하게 사용할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 Sporosarcina pasteurii를 이용하였다.

생물학적 고결 작용은 암모니아의 고농집을 발생시키는 결과를 야기하며, 이러한 박테리아 물질의 조건은 암모니아의 발생을 조정하여 요소분해효소가 저하되지 않는 경우에 유용하다. 이러한 유기체로는 Sporosarcina pasteurii와 Proteus vulgaris 등의 요소분해효소활동을 하는 Bacillus Pasteurii 계열의 일명 요소박테리아가 있다.

Ferris et al. (1996)은 대표적인 탄산칼슘을 석출하는 미생물은 방선균인 Sposarcina pasteruii (Bacillus)로 알려져 있으며, 많은 미생물 중 가장 활성하게 요소분해효소와 효소반응을 한다고 하였으며, 본 미생물이 요소를 에너지 자원으로 활용하여 암모니아를 생성하고, Ca²⁺이온과 CO₃^2-이온을 결합시켜 탄산칼슘 (CaCO₃)를 석출한다.

Ⅲ. 재료 및 방법

1. 시료 성형 및 시험⋅분석방법

본 연구에서는 미생물을 이용하여 흙입자와의 반응에 탄산칼슘의 일종인 vateraite의 생성반응 메카니즘을 알아보고자 토사와 미생물, 혼화제 및 침강제의 비율을 조정한 다양한 배합조건에서 실내시험과 토사와 미생물의 반응 메카니즘 분석을 실시하였다. 이중 실내시험은 먼저 흙 시료 (광주광역시 ○○지구 택지조성 공사현장에서 채취한 화강풍화토 계열의 토사를 No. 10체로 체가름)에 대한 다짐시험을 실시하였고 얻어진 결과를 바탕으로 최적함수비를 결정하여 공시체 제작에 있어서 다른 함수비를 적용하였다. 또한, 석회석을 포함한 지반을 형성하기 위해 소석회를 시료전체중량에 3%를 첨가한 시료를 제작하여 비교⋅분석에 사용하였다. 또한, 적절한 미생물과 침강제를 흙과 배합한 시료에 Jack를 이용하여 일정한 압력을 가하여 정적으로 일체 다짐에너지를 가하였다. 메카니즘 분석은 전자 현미경 분석 (SEM)을 통하여 각 조건에 따른 결정상, 형상, 입자 크기의 변화 과정을 살펴보고, X-선회절 분석 (XRD)시험을 수행해, 각 조건에 따른 화학분자식 및 구성 광물을 파악하였다.

본 연구에서 사용한 화강풍화토의 물리적 특성을 정리한 것이 Table 2이다. #200체 2.66%이며 통일분류법 (USCS)에 의하면 입도불량인 모래 (SP)로 분류되었으며, 입도분포곡선을 나타낸 것이 Fig. 1이다.

Table 2

Physical properties of weathered granite soil

Contents	Gs	Wn (%)	LL (%)	PI	#200	USCS	Remarks
Soil	2.69	18.21	N.P		2.66	SP

Fig. 1

Granular distribution curve of weathered granite soil

2. 미생물, 침강제, 혼화제 구성

미생물은 Whiffin (2004)이 제안한 것 중에서 호기성인 Bacillus pasteurii계열인 Sporosarcina pasteurii를 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 균배양체로 균주를 분양 받았으며, 배지는 medium (yeast extract) 1 add 20 g urea의 비율로 조성하여 박테리아 용액 (bacteria solution)의 요소 농도를 1.5 M로 하였다.

침강제 (Fix제) 용액은 염화칼슘 (CaCl₂)과 질산칼슘 (Ca(NO₃)₂)을 각각 0.75 M로 조성하였으며, 혼화제는 소석회 (Ca(OH)₂)를 사용하였으며 시료중량에 3%를 첨가하였다.

본 연구에서 공시체는 높이 105 mm, 지름 52 mm (체적 212.37 cm³)의 PVC 몰드를 제작하여 사용하였고, 상⋅하판 및 PVC 몰드 내부에 실리콘 그리스를 얇게 도포함으로써 다짐완료후 공시체의 분리를 용이하게 하였으며, 각각의 배합형태별로 를 일정하게 유지하며, Jack을 이용하여 일정한 압력을 가하여 정적으로 다짐을 실시하였다 (BS1377: Part 4:1990:5.4). 그리고 Fig. 2는 공시체를 성형하기 위한 PVC와 하판의 장비를 나타낸 것이며, Fig. 3은 후술하는 공시체의 혼합비 및 종류별로 성형된 공시체의 전경을 나타낸 것이다.

Fig. 2

Apparatus of making specimen

Fig. 3

Front view of specimens formed by mixing ratio and types of specimens

미생물과 토사의 반응 메카니즘을 알아보기 위한 토사와 미생물 혼합물의 탄산칼슘 생성 반응을 알아보기 위해 사용된 공시체는 SW (토사+물), SB (토사+미생물), SBF (토사+미생물+침강제), SBC (토사+미생물+혼화제), SBCF (토사+미생물+혼하제+침강제)의 명칭은 편의상 알파벳 첫글자로 하였으며, 배합은 총 5종류로 각각 함수비를 15%, 20%, 25%로 구분하여 3일, 7일, 14일, 28일 양생기간으로 각 3개씩 180개의 공시체를 제작하였으며, 각각 혼합비율 및 배합비를 나타낸 것이 Table 3과 같다.

Table 3

Mixing ratio of specimen

Name of Mixture Group*	Units (g)					Addition ratio (%)	Water Contents (%)
	Soil	Ca(OH)2	Bacteria solution	Water	Fixature
SW-15	377	-	-	56.55	-	-	15
SB-15	377	-	56.55	-	-	-
SBF-15	377	-	28.28	-	28.28	-
SBC-15	377	11.31	58.25	-		3
SBCF-15	377	11.31	29.12	-	29.12	3
SW-20	377	-	-	75.4	-	-	20
SB-20	377	-	75.4	-	-	-
SBF-20	377	-	37.7	-	37.7	-
SBC-20	377	11.31	77.66	-	-	3
SBCF-20	377	11.31	38.83	-	38.83	3
SW-25	377	-	-	94.25	-	-	25
SB-25	377	-	94.25	-	-	-
SBF-25	377	-	47.13	-	47.13	-
SBC-25	377	11.31	97.08	-	-	3
SBCF-25	377	11.31	48.54	-	48.54	3

* SW (soil+water), SB (soil+bacteria solution), SBF (soil+bacteria solution+fixture), SBC (soil+bacteria solution+Ca(OH)₂), SB (soil+bacteria solution), SBCF (soil+bacteria solution+Ca(OH)₂+fixture)

Ⅳ. 결과 및 고찰

1. 미생물 용액과 침강제의 반응 분석 결과

미생물 용액 (bacteria solution)과 침강제 (fixature)를 비이커에 1: 1 비율로 혼합하여 수행한 실험 결과, 반응과정에서 침전물이 생성되는 현상을 확인할 수 있었다. 이 침전물을 건조시킨 후 한국기초과학지원연구원 광주분원에 전자현미경분석 (SEM)과 X-회절분석 (XRD)을 수행하였다.

Fig. 4는 미생물 용액과 침강제의 혼합과정을 나타낸 것으로 전자현미경분석 (SEM) 결과, 침전물의 형태는 불규칙한 크기의 미세한 구형의 형상을 나타내었으며 (Fig. 5 참조), X-회절분석 (XRD)결과 구성물로는 철, 탄산칼슘, 규산염, 규화물 등의 물질들이 생성된 것으로 나타났다. 또한 생성된 탄산칼슘 (CaCO₃)은 분산성이 좋고, 반응성이 높은 것으로 알려진 바테라이트 (vaterite)로 나타났다. 이는 Park et al. (2011)의 미생물의 고결작용과 고결모래의 강도증진에 관한 연구결과에서의 탄산칼슘 생성반응과 유사한 결과를 나타냈다. 이를 통해 향후 본 연구결과를 토대로 다양한 토양과 미생물 혼합에 따른 강도증가 특성에 관한 연구가 필요할 것으로 판단된다.

Fig. 4

Mixing process to bacteria solution and fixture

Fig. 5

Result of SEM for bacteria solution and fixture (20 kV × 500)

2. 시험조건에 따른 미생물 고결토의 반응 결과

가. 전자현미경분석 (SEM)

미생물 고결토의 공시체의 각 종류별 미세구조 입자의 변화를 파악하기 위하여 양생 28일 후의 시료들을 20.0 kV ×5.00 k배율로 SEM분석을 수행하였으며, 그 결과를 나타낸 것이 Fig. 6(a)~(e)에 나타내었다. Fig. 6(a)는 토사에 물만을 첨가한 것으로 그 형상은 각 입자의 주위에 크고 많은 공극이 존재하고 입자간의 결합은 엉성한 결합상태를 보였다. Fig. 6(b)는 토사에 미생물만 첨가한 공시체 (SB)로 각 입자의 주위에 큰 공극들이 존재하나 입자 간의 결합상태는 SW에 비해 촘촘해진 것을 볼 수 있다. Fig. 6(c)는 토사에 미생물과 침강제를 첨가한 공시체 (SBF)로 그 형상이 입자 간의 공극과 결합상태는 SB와 유사한 형태를 보이고 있다. Fig. 6(d)는 혼화재가 혼합된 토사에 미생물을 첨가한 공시체 (SBC)로 그 형상이 입자 간의 공극과 결합상태가 조밀해지고 괴상을 나타내는 것을 알 수 있다. Fig. 6(e)는 혼화제가 혼합된 토사에 미생물과 침강제를 첨가한 공시체 (SBCF)로 입자사이의 공극이 거의 없고 촘촘해진 것을 알 수 있다 (SW와 SBCF의 비교). 이처럼 혼화제외 침강제의 혼합에 의해 생성된 수화물이 토사 입자의 주위의 공극을 메워 입자간의 고결력과 건조밀도 증가로 이어져 강도의 증가로 이어질 것으로 판단된다 (Park et al., 2014).

Fig. 6

Results of SEM analysis (20.0 kV×500)

나. X-회절 분석 (XRD) 결과

본 시험에서는 미생물, 침강제, 혼화제 등이 첨가된 공시체에 미생물, 침강제를 혼합하였을 때 나타나는 반응생성물을 조사하기 위하여 X-회절분석을 수행하였다. Fig. 7은 XRD 분석결과의 일례로 SBF 샘플의 결과를 나타낸 것이다. 그림에 나타낸 것처럼 미생물과 침강제의 혼합으로 생성된 탄산칼슘이 나타났다. XRD 분석의 각 시료의 분석을 통해 생성된 물질을 나타낸 것이 Table 4이다. 표에서 알 수 있는 것처럼 국내의 일반적인 화강풍화토인 경우, 탄산칼슘 생성을 유발하는 SiO₂는 생성되지 않고, 그 외 미생물, 혼화제 및 침강제를 혼합한 시료에서 생성된 것으로 나타났다.

Table 4

Each product of reaction by a XRD analysis

Contents	Chemical formula	Mineral name
SW	None	None
SB	SiO2	Silicon Oxide
SBF	SiO2	Silicon Oxide
SBC	SiO2	Silicon Oxide
SBCF	SiO2	Silicon Oxide

Fig. 7

Results of XRD peak graph (SBF sample)

또한 각각의 공시체에 대한 XRD 분석 결정강도의 Peak 값 순으로 정리한 것을 Table 5~9에 나타내었다. Table 5~9의 결과로부터, 미생물과 침강제에서 생성된 탄산칼슘 중의 하나인 바테라이트가 다른 기질들과 반응성이 좋은 특성을 지니고 있어, 바테라이트가 다시 간극수의 수소이온농도나 산화환원 전위가 변화, 용해되는 교대작용으로 규산(SiO₂)이 생성된 것으로 판단할 수 있다. Kim et al. (2013)은 Bacillus 균의 배양과정을 통해 미생물과 요소가 반응하여 탄산이온(CO₃^2-)와 두개의 암모늄이온(NH42+)로 가수분해되고, 균은 생성된 탄산이온과(CO₃^2-)과 염화칼슘(CaCl₂) 수용액의 칼슘이온(Ca²⁺)이 반응하여 (CaCO₃)가 생성된다고 하였으며, 본 연구에서도 유사한 결과를 나타내었다(반응식 : ) 또한 Lee (2013)은 Fig. 8에 나타낸 것처럼 토립자사이의 Bacteria가 건조와 고화작용을 통해 미생물이 증식되고 차츰 탄산칼슘이 증식되는 과정을 나타내었다.

Table 5

List of reaction results on XRD for SW specimen

Card No	Chemical formula	Mineral name
35-0411	KNd(MoO4)2	Potassium Neodymium Molybdenum Oxide
39-0119	Li4P4O12BH2O	Lithium Phosphate Hydroxide
37-0526	Cu3(SO4)2(OH)2	Copper Sulfate Hydroxide
29-0411	CsLiSeO4	Cesium Lithium Selenate
40-0842	BaHgS2	Barium Mercury Sulfide
33-0345	CsBa(PO3)3H2O	Cesium Barium Phosphate Hydrate
31-0542	GaGeO5WO5O4	Gallium Germanium Tungsten Oxide
45-0732	CI4 H2I Ce2 CsOI4	Cesium Cerium Acetate
46-0275	Cs2 Mn(PO3)4	Cesium Manganese Phosphate

Table 9

List of reaction results on XRD for SBCF specimen

Card No	Chemical formula	광물명칭(Mineral name)
43-0596	SiO2	Silicon Oxide
35-0395	CsRbWO4	Cesium Rubidium Tungsten Oxide
36-1149	IrSix	Iridium Silicide
31-0524	GaGeO5WO5O4	Gallium Germanium Tungsten Oxide
33-1286	Na2S2O4	Sodium Sulfate
33-0394	Cr2H2As6O19	Chromium Hydrogen Arsenate
35-0411	KNd(MoO4)2	Potassium Neodymium Molybdenum Oxide
43-0548	K3AlB8O15	Potassium Aluminum Borate
37-0526	Cu3(SO4)2(OH)2	Copper Sulfate Hydroxide
36-0207	LiSc(MoO4)2	Lithium Scandium Molybdenum Oxide

Fig. 8

Concept of microbial growth and calcium carbonate formation using organic acids (Lee, 2013)

Table 6

List of reaction results on XRD for SB specimen

Card No	Chemical formula	Mineral name
43-0596	SiO2	Silicon Oxide
35-0395	CsRbWO4	Cesium Rubidium Tungsten Oxide
13-0487	EuBO3	Europium Borate
46-1045	SiO2	Quartz syn
39-0119	Li4P4O12BH2O	Lithium Phosphate Hydroxide
37-0526	Cu3(SO4)2(OH)2	Copper Sulfate Hydroxide
33-1286	Na2S2O4	Sodium Sulfate
43-0548	K3AlB8O15	Potassium Aluminum Borate
36-1149	IrSix	Iridium Silicide
31-0524	GaGeO5WO5O4	Gallium Germanium Tungsten Oxide

Table 7

List of reaction results on XRD for SBF specimen

Card No	Chemical formula	Mineral name
37-0652	K3Sc(SO4)3	Potassium Scandium Sulfate
35-0395	CsRbWO4	Cesium Rubidium Tungsten Oxide
37-0526	Cu3(SO4)2(OH)2	Copper Sulfate Hydroxide
33-1286	Na2S2O4	Sodium Sulfate
33-0394	Cr2H2As6O19	Chromium Hydrogen Arsenate
35-0411	KNd(MoO4)2	Potassium Neodymium Molybdenum Oxide
12-0708	SiO2	Silicon Oxide
45-0275	CsMgPO4	Cesium Magnesium Phosphate
35-0160	Ba10P6O25	Barium Phosphate
37-1240	Gd(ReO4)3	Gadolinium Rhenium Oxide

Table 8

List of reaction results on XRD for SBC specimen

Card No	Chemical formula	Mineral name
41-1487	C	Graphite-2H
43-0596	SiO2	Silicon Oxide
36-1149	IrSix	Iridium Silicide
33-1286	Na2S2O4	Sodium Sulfate
37-1430	Ga1.56CdO.66Te3	Cadmium Gallium Telluride
45-1297	Cu1.50ZnO.30Te	Copper Zinc Telluride
34-0580	LiBH4	Lithium Boron Hydride
10-0423	AlPO4	Berlinite, syn
37-0526	Cu3(SO4)2(OH)2	Copper Sulfate Hydroxide
45-0275	CsMgPO4	Cesium Magnesium Phosphate

Ⅴ. 결 론

미생물과 토사의 반응 메카니즘을 파악하기 위하여 다양한 조건에서 토사와 미생물 등 첨가제를 변화시킨 조건에서 실내시험을 침강제를 혼합한 후 반응생성물과 각각의 공시체를 전자현미경분석 (SEM)과 X-회절분석 (XRD)시험을 실시한 결과를 정리하면 다음과 같다.